Одним из ключевых механизмов поддержания вирусной персистенции является модуляция программированной клеточной смерти. Показано, что при вирусных инфекциях сосуществуют факторы, индуцирующие и ингибирующие апоптоз клеток [1–5]. Вирусам целесообразно подавить апоптоз вирусинфицированных клеток, так как они могут размножаться лишь в живых клетках. Исход инфекционного процесса связывают с результатом противостояния антиапоптотической способности вирусов и активации физиологической гибели инфицированных клеток как части защитного механизма организма [6, 7]. Одним из возможных механизмов противостояния вирусной инфекции защитным силам макроорганизма является изменение рецепторного фенотипа клеток.
Целью исследования было изучение особенностей экспрессии рецепторов CD95, DR5 при хронических гепатитах В (ХГВ) и С (ХГС) и при папилломавирусной инфекции разного онкогенного риска.
Материалы и методы
Под нашим наблюдением находилось 113 больных хроническими вирусными гепатитами в возрасте от 18 до 76 лет, которые проходили стационарное лечение в Центре профилактики и борьбы со СПИДом и инфекционными заболеваниями Минздрава Кабардино-Балкарской Республики. Преобладали лица мужского пола (88%). 76 больных страдали ХГВ, 37 пациентов – ХГС. При ХГВ длительность заболевания к моменту поступления составляла 7,8 года, при ХГС – 11,2 года. Клиническое обследование больных вирусными гепатитами показало, что все пациенты распределялись по уровню клинико-биохимической активности: у 32 больных имелась минимальная активность (0–1 N АлАТ), у 77 – умеренная степень активности (2–4 N АлАТ) и у 46 – высокая степень активности (>4 N АлАТ). Диагноз был поставлен на основании клинико-эпидемиологической и молекулярно-биохимической оценки. У всех пациентов определяли маркеры вирусных гепатитов методом ИФА (тест-системы «Вектор-Бест», Россия), ДНК вируса гепатита В, РНК вирусов гепатита С, Д методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-систем «АмплиСенс» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва).
Под наблюдением также находились 96 женщин с папилломавирусной инфекцией (ВПЧ) в возрасте от 21 года до 45 лет. У всех пациенток ВПЧ-инфекция подтверждалась результатами ПЦР-анализа. Цитологические изменения при кольпоскопии у женщин с ВПЧ высокого онкогенного риска (койлоцитарная атипия, наличие в мазках двухъядерных и многоядерных клеток, амфофилия цитоплазмы и пр.) были обнаружены у 24 (50%) из 48 пациенток. При ВПЧ низкого онкогенного риска (48 женщин) цитологические изменения при кольпоскопии не зарегистрированы. В группу контроля вошли 20 здоровых доноров, у которых не обнаружены антитела к ВПЧ и ДНК вируса простого герпеса, цитомегаловируса и других инфекций, передающихся половым путем.
Оценку рецепторной структуры клеток лейкоцитарной фракции осуществляли стандартным методом прямого двухпараметрического иммунофлюоресцентного окрашивания с использованием коммерческих лизирующих/фиксирующих (CellLyse, ВD) и промывающих растворов (CellWash, BD) и панели моноклональных антител (IOTest, Beckman Coulter) – антиCD95-FITC/антиDR5+-PE (Caltag Labs). При обследовании женщин с ВПЧ-инфекцией дополнительно оценивали рецепторный фенотип клеточных элементов цервикального канала.
При математической обработке результатов исследований были использованы следующие методы: расчет средних значений и доверительный интервал, рассчитанные по данным n измерений. Доверительный интервал оценивали с использованием критерия Стъюдента для р<0,05. Статистическую обработку и расчет коэффициента корреляции проводили с использованием программы Microsoft Excel.
Результаты и обсуждение
Обнаружено достоверное повышение процента CD95+-лейкоцитов у больных ХГВ и ХГС по сравнению с аналогичным показателем в группе здоровых доноров (табл.1). При анализе полученных данных в зависимости от этиологии гепатита оказалось, что при вирусных гепатитах В и С происходит достоверное повышение CD95, однако этот показатель выше у больных ХГС. Следует отметить, что изменение изучаемого показателя зависело от степени биохимической активности. Процент CD95+-клеток был выше у больных с высокой биохимической активностью.
* – достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых лиц;
** – достоверность различий по сравнению с показателями у пациентов с ХГВ.
Увеличение количества CD95+-лимфоцитов у обследованных нами пациентов следует рассматривать, по-видимому, как адекватную реакцию организма на элиминацию инфектогена, так как основной функцией Fas-рецептора является индукция апоптоза.
При изучении экспрессии другого рецептора (DR5) лиганда из группы ФНО-индуцирующих апоптоз – TRAIL на лейкоцитах периферической крови выявлено, что в обеих группах у пациентов с ХГВ и ХГС достоверно повышается экспрессия рецептора TRAIL на лейкоцитах периферической крови (табл. 2). Следует отметить, что наиболее высокие показатели получены в группе пациентов с ХГС. Помимо этиологии, изучаемый фактор зависел от степени биохимической активности гепатита. Достоверно более высокие значения были получены у больных ХГС при высокой биохимической активности.
Примечание. р – достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых; р1 – достоверность различий по сравнению с показателями у больных ХГВ.
При исследовании клеток лейкоцитарной фракции при ВПЧ-инфекции обнаружено значительное (38,4%) снижение уровня CD95+-клеток при вирусной инфекции высокого онкогенного риска, при отсутствии значимых изменений экспрессии рецептора смерти при ВПЧ низкого онкогенного риска (табл. 3). Низкий уровень CD95+-клеток является одной из основных причин нарушения апоптических процессов в зараженных интегративными вирусами клетках. Общий уровень CD95+-клеток среди клеточных элементов цервикального канала женщин независимо от типа ВПЧ-инфекции снижен, но достоверность различий обнаружена только при ВПЧ-инфекции высокого онкогенного риска (см. табл. 3).
* – р<0,05 по сравнению с показателями у доноров.
При исследовании рецептора к TRAIL при папилломавирусной инфекции общий уровень DR5+-клеток в цервикальной жидкости женщин независимо от типа ВПЧ-инфекции оказался неизмененным (данные не приведены).
Проведенное нами исследование показало, что у больных ХГВ и ХГС активируется FAS-опосредованный апоптоз, результатом чего явилось усиление экспрессии рецептора FAS на лейкоцитах периферической крови, более выраженное у больных ХГС с высокой биохимической активностью. Такая благоприятная, казалось бы, ситуация для элиминации вирусов гепатита, с одной стороны, не подтверждается в ряде работ по исследованию экспрессии гена FAS непосредственно в гепатоцитах, в которых происходит снижение экспрессии исследуемого гена, из чего можно сделать вывод о способности ингибировать FAS-индуцируемый апоптоз антигенами вируса гепатита С, но такой зависимости не обнаружено у пациентов с ХГВ [8–10]. Исследование показателей TRAIL позволяет говорить о дефиците сывороточного TRAIL за счет повышения экспрессии TRAIL-рецептора не только на мембране лейкоцитов, но и на гепатоцитах [11]. С другой стороны, J. Du и соавт. [12] указывают на ингибирование TRAIL-индуцированного апоптоза cor-антигеном вируса гепатита В в печеночной паренхиме.
Напротив, при ВПЧ-инфекции выявлена зависимость показателей от степени онкогенного риска инфекции. Не исключено, что при данном заболевании снижение экспрессии CD95 и готовности клеток к спонтанному апоптозу является неблагоприятным признаком, так как оно ассоциировано с переключением на менее эффективный при вирусной инфекции гуморальный путь иммунной защиты и с присущими такому переключению проявлениями иммуносупрессии.
Таким образом, вирусы могут индуцировать или блокировать апоптоз в зараженной клетке, как за счет специфического действия продуктов вирусных генов, так и в результате изменения свойств поверхностной мембраны клетки, что делает ее мишенью для цитотоксических иммунокомпетентных клеток. Изучение механизмов цитопатического действия вирусов, а также нарушений регуляции программируемой клеточной гибели в этом процессе необходимо для понимания механизмов взаимоотношений вирус – клетка-хозяин – макроорганизм.
