Для активной иммунопрофилактики чумы в Российской Федерации выпускается лицензированный, имеющий государственную регистрацию медицинский иммунобиологический (лекарственный) препарат Vaccine plague1. Он представляет собой взвесь живых бактерий вакцинного штамма чумного микроба EV линии НИИЭГ, лиофилизированного в сахарозо-желатиновой среде с тиомочевиной (СЖТ) или в других рекомендованных защитных средах.
Многоэтатапность процесса биотехнологии вакцины, большое количество факторов и их взаимосвязей, влияющими на конечный результат, (условия выращивания культуры, качество питательной и защитной сред, время и температура высушивания суспензии, режим замораживания и сублимация растворителя в вакуумной камере, а также другие технологические приемы) обусловливают необходимость применения системного подхода к оптимизации этапов биотехнологии вакцины [1, 2].
Получение генетически измененных вариантов штамма Yersinia pestis EV, несущих в геноме детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам, стимулирует разработку новых защитных сред для конструирования полирезистентных вакцин. Системный подход с использованием математических моделей был применен ранее для оптимизации этапов биотехнологии таких вакцин, как гриппозная гликопротеидная мультивалентная вакцина «Грипповак», полиомиелитная и антирабическая вакцины [3, 4]. Первые опыты математического моделирования живой сухой чумной вакцины (разработка защитных сред и режимов лиофилизации) были проведены в 1990-х годах [5, 6]. В последнее десятилетие успешно проводятся научно-исследовательские работы по математическому моделированию технологии получения живой сухой таблетированной вакцины против чумы [7, 8].
Одним из главных факторов при лиофилизации микроорганизмов является состав защитных сред, который обеспечивает защиту микробных клеток от повреждений, возникающих в процессе лиофилизации (замораживание, удаление воды из замороженных суспензий под вакуумом и др.) [9, 10].
Цели исследования – оптимизация с помощью методов полного факторного эксперимента количественных соотношений ингредиентов защитной среды СЖТ, рекомендуемой регламентом, для лиофилизации референтного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ, и разработка защитных сред для его генетически измененных вариантов, несущих в геноме детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам.
Материалы и методы
Экспериментальные серии вакцины готовили на основе 3 вакцинных штаммов чумного микроба: Yersinia pestis EV линии НИИЭГ (референтный штамм) и 2 генетически сконструированных штаммов с хромосомной и плазмидной устойчивостью к антибиотикам – Y. pestis EVA и Y. pestis EV76 R16 [11]. Культуры выращивали на плотной питательной среде «СО», состоящей из непищевого сырья: автолизата селезенки, гидролизата белка пшеничных отрубей, хлористого натрия, сернокислого натрия, агара японского пластинчатого или Корсаковского и дистиллированной воды (рН 7,4) [12]. Лиофилизацию осуществляли на камерной лиофилизационной установке LZ–9CP фирмы «Фригера» (Чехия).
Стандартная пропись защитной среды СЖТ (10% сахарозы, 1% желатины, 1% тиомочевины; рН 7,6) была использована в качестве контрольной. Для получения оптимальных композиций на основе компонентов среды СЖТ в работе был применен метод полного факторного эксперимента с 3 (ПФЭ 23) и 4 переменными (ПФЭ 24) [13].
В соответствии с этим методом количественные соотношения ингредиентов среды СЖТ варьировали в опыте для каждого из 3 опытных вакцинных штаммов по предложенной матрице.
Согласно матрице, исследуемые факторы рассматривали на 2 уровнях:
- 1-й фактор – сахароза, верхний уровень – 15%, нижний – 5%;
- 2-й фактор – желатин, верхний уровень – 2%, нижний – 0,5%;
- 3-й фактор – тиомочевина, верхний уровень – 3%, нижний – 0,5%;
- 4-й фактор – рН, верхний уровень – 10%, нижний – 6%.
Области варьирования факторов определены с помощью предварительных экспериментов. Для каждого опытного штамма (Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis EVA и Y. pestis EV76 R16) приготовлено по 15 вариантов защитных сред с различными комбинациями исследуемых факторов, которые были использованы для лиофилизации. По результатам проведенных экспериментов построены математические модели процессов, позволяющие без проведения натурных экспериментов рассчитать оптимальное количественное соотношение компонентов защитных сред для каждого штамма, обеспечивающее наибольшее количество жизнеспособных клеток после лиофилизации. Модели как прогностические уравнения были использованы после проверки их адекватности: ∑= yn2 – N∑n bi2 = 0 (1), расчета коэффициентов уравнений регрессии по схеме Иейтса, определения статистической значимости коэффициентов уравнений регрессии. Рассчитана дисперсия воспроизводимости результатов опыта S2 (y) и дисперсия коэффициентов регрессии S2 (bi). Для подтверждения статистической достоверности коэффициентов регрессии использовали критерий Стьюдента. Абсолютные значения коэффициентов уравнения регрессии считали значимыми, если выполнялось неравенство:
Bi > t√s2 {bi} (2),
где Bi – коэффициенты членов модели.
Результаты
После реализации 3 серий опытов для каждого опытного штамма в соответствии с матрицей планирования составлены математические модели процесса.
Модель защитной среды № 1 для лиофилизации экспериментальных серий вакцины на основе эталонного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ:
Y = 4,05 + 3,37х1 + 0,69х3 + 0,86х4 + 0,8х1х3 + 0,9х1х4 – 0,6х2х3 – 0,74х1х2х3 – 0,58х1х2х4 Bi > 0,48 (1)
Несущественным фактором при взятых в опыт значениях оказался желатин, который был взят для расчета на исходном уровне. Полученное уравнение регрессии было использовано в качестве интерполяционной формулы, с помощью которой проведен расчет целевой функции Y, показывающей количество сохранившихся клеток после лиофилизации. Расчет модели был автоматизирован на ПВЭМ с использованием программы с генератором случайных чисел. В соответствии с расчетными данными прогнозированы наилучшие количественные сочетания изучаемых ингредиентов защитной среды, которые обеспечивали наиболее высокую жизнеспособность клеток после лиофилизации. На основе полученных данных сконструирована защитная среда следующего состава: сахароза – 14–15%, желатин – 1%, тиомочевина – 2,5–3%; рН 10, которая превосходила защитные свойства контрольной среды в 1,9–2 раза и отличалась от контрольного варианта повышенным содержанием сахарозы на 50%, тиомочевины – в 2,5–3 раза и рН – на 2,4 единицы (табл. 1). Изучена иммуногенность экспериментальных серий вакцины с использованием сконструированной защитной среды.
В 3 сериях контрольных экспериментов выявленная тенденция повышения устойчивости микробных клеток к лиофилизации с использованием оптимизированной защитной среды оставалась неизменной. Иммуногенность лиофилизированных серий вакцины, полученных с применением оптимизированной защитной среды, соответствовала нормативам.
Модель защитной среды № 2 для лиофилизации экспериментальных серий вакцины на основе полирезистентного штамма Y. pestis EVA (с хромосомной изменчивостью):
Y = 3,3 + 2,0х1 + 0,39х2 + 0,43х3 + 0,85х4 – 0,69х1х2 – 0,28х2Х3 – 0,6х1х2х3 + 0,6х1х4 – 0,33х2х4 – 0,28х1х3х4 – 0,44х1х2х3х4 Bi > 0,21 (2)
Статистический расчет модели показал, что в данном уравнении все взятые в опыт ингредиенты защитной среды являются значимыми. Поиск оптимальных значений ингредиентов с использованием ПЭВМ выявил лучшие их количественные сочетания в защитной среде, которые находились на границе области исследования. В таких случаях предусматривается реализация метода крутого восхождения (метода Бокса–Уилсона) с выходом за пределы изученной области. На основе полученной модели с учетом знака «+» или «-» и величины коэффициентов членов модели составлен план дополнительного эксперимента с теоретически рассчитанными компонентами среды (табл. 2).
Наилучшие показатели выживаемости клеток после лиофилизации обеспечила защитная среда следующего состава: сахароза – 15%, желатин – 0,8%, тиомочевина – 1,75%, рН 10. Количество клеток после лиофилизации в экспериментальных сериях вакцины EVA после лиофилизации в 3–5 раз превосходило аналогичный показатель контрольной среды.
Модель защитной среды № 3 для лиофилизации экспериментальных серий вакцины на основе полирезистентного вакцинного штамма Y. pestis EV76 R 16.
Для этого штамма конструирование оптимизированной защитной среды осуществляли с использованием метода ПФЭ 23 . Переменными являлись 3 фактора: х1 – сахароза, х2 – желатин, х3 – тиомочевина. Математическая модель защитной среды № 3 для лиофилизации экспериментальных серий вакцины была представлена следующим уравнением:
Y = 28,6+4,3х1 +2,5х2 +6,6х3 +1,4х1 х3+10 х2х3 – 3,4 х3 х2 Bi >1,37 (3).
После соответствующих расчетов модели на ПЭВМ оптимальные концентрации ингредиентов составили: сахароза – 5%, желатин – 2%, тиомочевина – 2%. Защитные свойства этой оптимизированной среды оказались выше, чем контрольной, что позволило сохранить в экспериментальных сериях вакцины после лиофилизации в 1,5 раза больше клеток полирезистентного штамма Y. pestis 76R 16, чем при использовании контрольной защитной среды.
Обсуждение
Для предотвращения повреждающих стрессовых воздействий на микробные клетки в процессе лиофилизации (осмотический, холодовой стресс, дегидратация и другие факторы) важное значение имеет подбор высокоэффективных защитных сред
Реализованные в работе методы математического моделирования позволили разработать оптимизированные рецептуры защитных сред с повышенными протективными свойствами при лиофилизации для каждого из 3 вакцинных штаммов чумного микроба Y. pestis EV линии НИИЭГ, Y. pestis EVA и Y. pestis EV76 R 16. Для каждого исследованного штамма оптимизированный вариант защитной среды был различным и обеспечивал неодинаковую защиту при лиофилизации. Наибольшую защиту создавала защитная среда, разработанная для полирезистентного штамма Y. pestis EVA с хромосомной устойчивостью к антибактериальным препаратам (сахароза – 15%; желатин – 0,8%; тиомочевина – 1,75%; рН 10), предохранившая бактериальные клетки от гибели в 3 раза успешней, чем контрольная среда СЖТ. Для этого штамма все ингредиенты сконструированной защитной среды были увеличены, кроме желатина.
Для штаммов Y. pestis EV линии НИИЭГ и Y. pestis EVA изменение содержания ингредиентов защитной среды заключалось в повышении количества сахарозы, тиомочевины и рН. Известно, что повышение концентрации сахарозы до 15% увеличивает осмотическое давление в клетке и вызывает в большей степени обезвоживание клеток до замораживания, в результате чего снижается вероятность образования внутриклеточного льда, разрушающего клетки в процессе лиофилизации [14, 15]. Кроме того, защитное действие углеводов при высушивании способствует понижению температуры фазовых переходов мембранных липидов и стабилизирует структуру белков в клетках [16], а повышенная концентрация антиоксиданта (тиомочевины) в сконструированных защитных средах снижает или останавливает ферментативные реакции и окислительные процессы в клетках, происходящие на этапах лиофилизации [17, 18].
Во всех сконструированных средах процентное содержание тиомочевины было повышено в 1,7, 2 и 3 раза по сравнению с контрольной средой, что сыграло большую роль в сохранении клеток во время лиофилизации. Оптимизированный вариант защитной среды для штамма Y. pestis EV76 R 16 (сахароза – 5%, желатин – 2%, тиомочевина – 2%) обеспечил увеличение выживаемости клеток после лиофилизации в 1,5 раза, видимо, за счет перераспределения концентраций антиоксиданта – тиомочевины (до 3%) других компонентов (желатина и сахарозы), а оптимизированная защитная среда для лиофилизации референтного штамма (сахароза – 14–15%, желатин – 1%, тиомочевина – 2,5%; рН 10) содержала 2 компонента (сахарозу и тиомочевину в более высоких концентрациях), увеличивающих ее протективные свойства.
Общая тенденция повышения количества микробных клеток в сконструированных защитных средах проявляется еще до лиофилизации, что может быть обусловлено явлением гормезиса, «парадоксального стимулирования», обеспечивающего формирование устойчивости клеток под влиянием высоких концентраций сахарозы и значений рН в период эквилибрации суспензии [19, 20].
Выводы
1. Оптимизированные с помощью методов полного факторного эксперимента защитные среды превосходят контрольный вариант среды СЖТ, способствуют увеличению выживаемости микробных клеток после лиофилизации с сохранением их иммуногенности.
2. Выявлены штаммовые различия количественного содержания ингредиентов в оптимизированных защитных средах. Наибольшую защиту обеспечила оптимизированная защитная среда, разработанная для полирезистентного штамма Y. pestis EVA (сахароза – 15%, желатин – 0,8%, тиомочевина – 1,75%; рН 10), сохраняющая после лиофилизации в 3 раза больше жизнеспособных клеток, чем контрольная среда СЖТ.
3. Применение методов математического планирования эксперимента позволило количественно скорректировать компоненты защитных сред для 3 взятых в опыт штаммов, значительно сократить время проведения опыта и снизить материальные затраты по амортизации применяемого оборудования.
