Научное познание мира невозможно без производства истинных знаний о действительности, оно нацелено на открытие объективных законов на основе обобщения реальных фактов. Каждый объект в процессе исследования рассматривается как большая и сложная система и одновременно – как элемент более общей системы, в этом заключается системный подход к процессу познания. В настоящее время для научных исследований принято выделять следующие методы познания: общелогический, эмпирический и теоретический. К общелогическим методам познания относятся анализ, синтез, сравнение, абстрагирование, обобщение, индукция, дедукция, аналогия и моделирование. Сущность моделирования как метода исследования состоит в воспроизведении отдельных признаков изучаемого объекта, для чего специально создается тождественная модель, замещающая его. Этот метод часто применяют в биологических и медицинских науках, когда исследования в реальных условиях функционирования объекта затруднительны, так как биологический и медицинский материал изменчив и подвержен влиянию многочисленных сложных факторов, взаимодействующих между собой. Иммунология, генетика, патогенез инфекционных заболеваний – это особо динамично развивающиеся сегодня отрасли медико-биологических дисциплин, где находят широкое применение методы экспериментального и математического моделирования.
Экспериментальное моделирование предусматривает использование в качестве моделей как животных, так и культуры клеток различных типов, выделенных из организма и поддерживаемых в жизнеспособном состоянии в искусственных условиях.
Математическое моделирование предполагает создание некоего математического описания, которое в определенной степени «задает» поведение исследуемых систем. Такое описание и называется математической моделью. Принято выделять 2 класса математических моделей: аналитические и имитационные. В первом случае свойства или поведение оригинала описываются математическими зависимостями [1]. В том случае, когда система-оригинал состоит из множества подсистем, поведение которых неопределенно и зависит от случайных внешних факторов, ее функционирование описывается имитационными моделями. Примером имитационного моделирования может служить математическая иммунология, сложившаяся в самостоятельную дисциплину в 70-х годах прошлого столетия. Одной из первых работ стала модель А.В. Молчанова, описывающая иммунный ответ системой из 2 дифференциальных уравнений [2]. J.S. Hege и G. Cole построили уравнение, описывающее изменение количества циркулирующих антител в зависимости от числа плазматических клеток [3]. Далее это направление развивали G.I. Bell [4], Г.И. Марчук [5], А.А. Романюха и соавт. [6].
Математическое моделирование – это способ строгой организации данных и логичного прогнозирования на основе математических гипотез [7]. Современные математические модели используют дифференциальные уравнения, теорию стохастических процессов, симуляцию на основе агентов, 3D-виртуальное моделирование и многое другое [8]. В предлагаемом обзоре представлены примеры имитационного математического моделирования с помощью дифференциальных уравнений инфекционного процесса, вызванного вирусом Эпштейна–Барр (ВЭБ).
ВЭБ представляет собой вирус герпеса человека 4-го типа, которым инфицировано примерно 95% населения планеты. Вирус обладает уникальными биологическими свойствами, он способен сохраняться в В-лимфоцитах практически каждого человека в течение всей его жизни [9]. В то же время показана его роль в развитии целого ряда различных новообразований лимфоидного и эпителиального происхождения, таких как лимфомы Беркитта, Ходжкина, СПИД-ассоциированные В-клеточные лимфомы, Т-лимфомы различного происхождения и др. [10]. Кроме того, исследованиями последних лет установлено, что инфекция, вызванная ВЭБ, является необходимым условием для развития рассеянного склероза, хотя точная его роль еще не полностью понятна [11].
ВЭБ был обнаружен в 1964 г., и к 2000 г. был накоплен большой объем информации, касающейся его молекулярной и клеточной биологии, иммунологии, эпидемиологии и клинических проявлений заболеваний, им вызванных. Однако результаты этих исследований были фрагментарны, и долгое время ученым не удавалось объяснить феномен пожизненной персистенции вируса. Например, было давно известно, что в отличие от большинства других герпесвирусов человека, ВЭБ способен существовать в культуре тканей (in vitro), а именно в пролиферирующих В-лимфобластах, росту которых способствуют латентные вирусные белки (процесс известен под названием «иммортализация»). Однако при дальнейших исследованиях было обнаружено, что in vivo вирус находится совсем в других клетках, а именно в В-клетках памяти, где экспрессии вирусных белков не происходит [12]. Для разрешения этого противоречия на основании экспериментальных исследований на культурах клеток и обобщения теоретических знаний D.A. Thorley-Lawson в 1999 г. предложил графическую модель зародышевого (герминативного) центра (рис. 1, см. на вклейке). В течение следующих 15 лет сотрудниками его научной группы были проведены биологические исследования, которые подтвердили надежность и предсказательность модели, описывающей жизненный цикл ВЭБ. Таким образом, было установлено, что для своей жизнедеятельности вирус приспособился использовать нормальные B-лимфоциты и эволюционировал впоследствии так, чтобы не нарушать гомеостаз организма хозяина.
Модель герминативного центра, она же циклическая модель патогена (cyclic pathogen model – CPM), наиболее удачно объясняет сложную биологию вируса [13]. Согласно этой модели, существование ВЭБ в организме хозяина может быть представлено в виде цикла из 6 стадий: стадия бластной клетки (пролиферации); стадия «герминативного центра» в лимфатическом фолликуле; стадия ВЭБ-инфицированных В-клеток памяти; литическая стадия генерации новых вирионов, состоящая из 3 подэтапов. Первая стадия цикла развивается в кровеносном русле, где инфицированные В-лимфоциты становятся пролиферирующими клетками-бластами. Вторая стадия происходит в герминативном центре лимфатического фолликула, куда мигрируют В-лимфоциты, дифференцирующиеся в B-клетки памяти; при этом происходит экспрессия всех вирусных генов, кодирующих латентные белки вируса. На этом этапе возможна злокачественная трансформация инфицированных клеток под действием генов белков латентной инфекции. Ген EBNA-1 играет важную роль в образовании стабильной, способной к неограниченному размножению («бессмертной») клеточной линии, а латентные мембранные белки LMP1, LMP2A и LMP2B осуществляют подавление реактивации вируса из латентного состояния [12]. Таким образом, циклическая модель дает объяснение происхождению ВЭБ-ассоциированных лимфом. Считается, что лимфома Беркитта и болезнь Ходжкина происходят из латентно инфицированных В-клеток герминативного центра, которые не смогли успешно дифференцироваться в В-клетки памяти [14]. В третью стадию В-клетки памяти циркулируют в периферической крови, редко экспрессируя вирусные белки (только EBNA-1) [15]. В-клетки памяти составляют более 90% всех В-лимфоцитов, но только около 2–3% из них способны к клеточному делению, что соответствует скорости деления нормальных В-клеток [7]. Период полураспада как ВЭБ-инфицированных, так и ВЭБ-неинфицированных В-клеток памяти практически идентичен и составляет 7,5 ± 3,7 и 11 ± 4 дня соответственно [16]. Таким образом, пул латентно ВЭБ-инфицированных В-клеток памяти копирует биологию нормальных В-клеток памяти организма-хозяина. Четвертую, литическую стадию процесса инициирует та часть латентно инфицированных В-клеток, которые дифференцируются в плазматические клетки. Эта стадия разбита на 3 дискретных подэтапа, независимо распознающихся иммунным ответом: немедленный ранний, ранний и поздний. В результате литического цикла происходит генерация новых вирионов, инфицирующих эпителиальные клетки лимфоидных образований кольца Пирогова–Вальдейера, где вирус воспроизводится с высокой скоростью и непрерывно высвобождается в слюну относительно стабильно в течение коротких периодов (часов, дней). При этом в течение более длительных периодов (месяц, год) уровень вирусовыделения изменяется довольно значительно – на 3,5–5,5 порядков [16] .
Контакт вирусных антигенов с клетками иммунной системы приводит к запуску иммунного ответа. Ведущую роль в элиминации ВЭБ-инфицированных клеток играет иммунный ответ по Т-клеточному типу с участием специфических цитотоксических CD8-лимфоцитов. У здоровых носителей вируса наблюдается динамическое равновесие между ВЭБ-инфицированными клетками и Т-клеточным ответом. Однако ВЭБ в ряде случаев вмешивается в регуляцию иммунного ответа цитокинами, вызывая угнетение иммунных реакций по клеточному типу. В результате происходит нарушение формирования противовирусного иммунного ответа по клеточному типу с его поляризацией в сторону Th2-типа [17].
Представленная выше циклическая модель патогена D.A. Thorley-Lawson, подтвержденная результатами исследований на биологических объектах, объяснила пожизненное существование ВЭБ в организме человека, его возможную роль в формировании соматической патологии, определяемую наличием иммунного контроля. Однако оставались нерешенными вопросы диагностических критериев активных форм ВЭБ-инфекции и определения показаний к проведению противовирусной терапии. С этой целью в 2011 г. группой ученых был дан детальный математический анализ циклической модели ВЭБ с помощью дифференциальных уравнений [18]. Так как на каждой стадии модели взаимодействуют по 2 популяции лимфоцитов (инфицированные В-лимфоциты и цитотоксические лимфоциты), то существуют 2 уравнения, описывающих скорость их изменения, – всего 12 уравнений для 6 стадий. Установлено, что только одно решение данной системы уравнений является биологически значимым, соответствующим устойчивому равновесию системы. Предполагается, что это уникальное, биологически значимое стабильное положение, стремящееся к равновесию при любом возмущении, соответствует длительной постоянной инфекции ВЭБ. Биологически это означает стабильно низкий уровень вирусной репродукции (примерно 1 инфицированная клетка на 5 мл крови) на протяжении всей жизни хозяина [16].
Гипотеза о том, что циклическая модель соответствует долгосрочной ВЭБ-инфекции, обсуждена в исследовании J.B. Hawkins и соавт. [15], в котором математически вычислена биологическая достоверность иммунного ответа на каждой из стадий инфекционного процесса. 6 стадий в теории имеют 26 (64) возможных комбинаций иммунного регулирования, и только 4 из них биологически достоверны. Именно эти 4 варианта контролируют практически все этапы ВЭБ-инфекции (93%). Оставшиеся 7% комбинаций никогда не были подтверждены в экспериментах на биологических объектах. Согласно выводам автора, в 93% случаев иммунному надзору подлежат пролиферирующие бластные В-лимфоциты, лимфоциты немедленной ранней и ранней литической стадий. То есть иммунная система способна предотвращать развитие опухоли и острого инфекционного процесса, вызванного ВЭБ, а ее неэффективность связана с индивидуальными генетическими особенностями организма-хозяина. Математическое моделирование также предсказывает варианты сочетания стадий цикла ВЭБ, недоступных иммунному надзору (по убывающей вероятности): 1) циркулирующие в периферической крови В-клетки памяти (55%), 2) В-клетки памяти и В-лимфоциты герминативного центра лимфатического фолликула (26%), 3) В-клетки памяти и В-лимфоциты поздней литической стадии (7,9%), 4) В-клетки памяти, В-лимфоциты герминативного центра и В-лимфоциты поздней литической стадии (3,8%). Предсказанное биологической моделью (и затем подтвержденное математически) существование вируса в виде замкнутого цикла объясняет устойчивость всей системы в отношении внешних воздействий, вызванных, например, введением антивирусного средства, что имеет важнейшее практическое значение для терапии ВЭБ-ассоциированных патологических состояний. Так, согласно расчетам, произведенным на модели, для того чтобы полностью устранить ВЭБ из организма, терапевтическое воздействие должно снижать производство вируса в 104 раза или более. Экспериментальное подтверждение этому было получено в исследовании Y. Hoshino [19], который определил, что валацикловир в дозе 500 мг в сутки способен эффективно очистить организм от ВЭБ в течение 11 (!) лет и только при условии, что за это время не произойдет реинфицирования другим штаммом ВЭБ.
ВЭБ способен инфицировать не только В-лимфоциты, но и эпителиальные клетки лимфоглоточного кольца, в которых инфекционный процесс всегда литический с выделением вируса в слюну (рис. 2, см. на вклейке).
Известно, что эпителий миндалин человека гетерогенен и содержит клетки, имеющие различную восприимчивость к ВЭБ in vitrо, что, возможно, определяет уровень вирусовыделения [20]. Предполагается, что к эпителиальным клеткам вирус доставляют В-лимфоциты, являющиеся основным резервуаром ВЭБ, далее происходят быстрый вирусный трансцитоз от апикальных к базолатеральным мембранам эпителиальных клеток и секреция вирусного потомства из эпителия в слюну [21]. Таким образом, в эпителиоцитах проходит полный цикл репликации ВЭБ с образованием большого количества вирионов, лизисом эпителиоцитов с последующим заражением соседних клеток [22]. Процесс вирусовыделения в слюну математически описан G.T. Huynh и соавт. [23] при помощи дифференциальных уравнений. В систему включили 3 переменные: количество инфицированных эпителиальных клеток в эпителии миндалин, количество цитотоксических Т-лимфоцитов, реагирующих на ВЭБ-инфекцию, и уровень вирусовыделения (вирусную нагрузку). Анализ системы уравнений показал, что для поддержания вирусовыделения достаточно вирусов, продуцируемых реактивированными В-лимфоцитами. Стабильное отсутствие вируса в слюне возможно только при отсутствии реактивации вируса в В-лимфоцитах. Инфекционный процесс в эпителиальных клетках исчерпывающим образом объясняет известный феномен вирусовыделения со слюной у здоровых ВЭБ-вирусоносителей, не коррелирующий с уровнем инфицированных В-клеток крови [16].
Таким образом, можно предположить, что для клинической оценки ВЭБ-ассоциированных патологических процессов может быть полезным определение вирусной нагрузки ВЭБ в клетках крови. Возможность использования значений вирусной нагрузки для диагностики герпес-ассоциированных состояний активно изучается. Так, опубликованы результаты исследований отечественных авторов, касающихся цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ), в которых показано, что как активная, так и латентная форма ЦМВИ сопровождаются выделением вируса в слюну; математически определены «пороговые» значения вирусной нагрузки, коррелирующие с клиническими проявлениями активных форм инфекции [24]. В исследовании, проведенном А.Д. Музыка и соавт. [25], продемонстрирована пороговая концентрация вируса герпеса человека 6-го типа в крови для диагностики активных форм инфекции у детей. Учитывая, что феномен пожизненной персистенции в организме человека является определяющей чертой всей группы герпесвирусов, в качестве сред исследования для определения клинически значимого количества вируса следует выбирать так называемые сайты латентности – иммунологически привелигированные участки, где вирус недоступен иммунному контролю. Для ВЭБ таким сайтом являются В-лимфоциты, для цитомегаловируса – моноциты, эпителиальные клетки и слюнные железы [26], для вируса герпеса 6-го типа (А, В) – Т-лимфоциты, моноциты, эпителиальные клетки почек и слюнных желез [27].
Описанные выше биологические и математические модели инфекционного процесса, несомненно, полезны и являются отражением нашего представления о природе такого биологического явления, как герпесвирусная инфекция. Математическое моделирование ВЭБ-инфекции открывает перспективы диагностики активных форм заболевания на основании исследования пороговых значений выделения вируса в различных средах организма человека и является отличным примером синергии математики и иммунологии, позволяющим расширить наши познания в этой сложной области.
